辣根過(guò)氧化物酶（HRP）是一種含亞鐵血紅素的蛋白質(zhì)，廣泛分布于植物界，以在辣根中含量高而得名，分子質(zhì)量約為40KDa。HRP作為酶標(biāo)記抗體是通過(guò)共價(jià)鍵經(jīng)適當(dāng)?shù)姆椒▽⒚嘎?lián)接在抗體上，形成酶標(biāo)抗體后再通過(guò)酶對(duì)底物的特異性催化作用，生成有色不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，利用肉眼、光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡可對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察。

　　

　　HRP標(biāo)記抗體用純化的待測(cè)物質(zhì)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入待測(cè)物質(zhì)，再與HRP標(biāo)記的待測(cè)物質(zhì)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色。

　　

　　操作步驟：

　　

　　1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋。

　　

　　2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

　　

　　3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

　　

　　4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。

　　

　　5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

　　

　　6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

　　

　　7.溫育：操作同3。

　　

　　8.洗滌：操作同5。

　　

　　9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。

　　

　　10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

　　

　　11.測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

　　

　　注意事項(xiàng)：

　　

　　1.在具備高質(zhì)量HRP的條件下，所要標(biāo)記的抗體也要活性高，效價(jià)高（z低1∶16），純度高，親和力好，這是保證標(biāo)記物效價(jià)高，免疫活性好的首要條件；

　　

　　2.所使用試劑的pH和濃度及用量必須嚴(yán)格掌握。所用試劑，新鮮配制。如在戊二醛標(biāo)記法中所用戊二醛應(yīng)為新鮮純品，因戊二醛儲(chǔ)存過(guò)久可形成縮和體（雜質(zhì)），否則影響標(biāo)記效果；

　　

　　3.室溫?cái)嚢钑r(shí)須避光，室內(nèi)溫度一般在25℃為宜。標(biāo)記物每次透析前，需認(rèn)真檢查防止漏液；

　　

　　4.濃的標(biāo)記物相當(dāng)穩(wěn)定，常加入30～40％甘油于-10℃下保存。4℃可保存1～2年，但稀釋成1∶10，只能保存數(shù)周。已配制的使用液應(yīng)在12小時(shí)內(nèi)用完。切忌反復(fù)凍融。